一种犬细小病毒的增殖方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及病毒培养技术领域， 进一步涉及疫苗抗原制备技术领域， 具体涉及一种犬细小病毒的增殖方法。

【背景技术】

犬细小病毒（CPV）属于细小病毒科细小病毒属，主要感染犬类，尤其是幼犬，健康犬感染CPV后，病毒主要攻击肠道上皮细胞和心肌细胞，分别表现出胃肠道症状和心肌炎症状。犬细小病毒具有极强的传染性，犬感染后死亡率较高。对于犬细小病毒感染病例，临床上主要以对症治疗配合高免血清、单克隆抗体治疗为主，从疗效、成本等方面考虑并不理想，一般以疫苗免疫为主才是对付病毒的根本措施。这就涉及到犬细小病毒抗原的增殖技术。

现有技术中犬细小病毒抗原生产主要采用细胞瓶培养法，瓶培养技术生产抗原病毒含量较低犬细小，仅为104n/CIDM/ml，不能提供稳定的合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量应≤1(f°TCIDM/ml)，需要进行高浓缩，且瓶培养技术劳动强度大，生产一批需要100-200个瓶，需要多人同时进行长时间的消化传代操作，增加污染风险；生产周期长，需要20天；效率较低，每次培养只能收获一次；生产成本较高，劳动力、场地及原料成本大；环保要求较高，需要较大的场地和GMP厂房；不同生产批次及同一生产批次的瓶培养之间存在较大差异，易造成批次内及批次间抗原质量差异，进而影响病毒抗原质量的稳定性； 烧瓶清洗需要大量的水，且产生的有毒废水需要特殊处理，极易污染环境，如处理不当会造成生物安全和公共卫生问题。

【发明概要】

[0004]本发明的目的在于提供一种犬细小病毒的增殖方法，解决现有技术培养效率低的技术问题。

[0005]本发明所要解决的另一个技术问题是现有技术中的犬细小病毒增殖方法质量不稳定。

[0006]本发明所要解决的另一个技术问题是现有技术中的犬细小病毒增殖方法产量较低。

为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

[0008]一种繁殖犬细小病毒的方法，该方法采用F81细胞作为宿主细胞繁殖犬细小病毒，采用torrent生物反应器作为细胞培养装置。

[0009] 优选地，所述方法先用torrent生物反应器培养F81细胞，再将犬细小病毒接种到细胞培养液中，使细小病毒增殖。

[0010] 优选地，所述F81细胞的培养采用微载体悬浮培养方式，在激流生物反应器中培养F81细胞。

优选地，该方法包括以下步骤：

1)将细胞培养液加入到torrent生物反应器中，按照（0.1μl）×16个细胞/mL培养液接种F81细胞，反应器内装有微载体；

[0013] 2)当细胞密度达到（1-10)×16个细胞/mL培养液时，将犬细小病毒以0.01-0.03MOI的接种量引入培养液中，继续培养细胞；

[0014] 3)将培养基固液分离，收集上清液，即得犬细小病毒溶液。

[0015] 优选地，步骤1)中加入的细胞培养液的量为激流生物反应器最大液体体积的1/2至3/4。

[0016] 优选的，步骤I)中接种的F81细胞采用EDTA-胰蛋白酶细胞分散液消化一种犬细小病毒的增殖方法，得到F81细胞悬液。

优选的，步骤2)中，当细胞密度达到(1-10)×16个细胞/mL培养液时，培养4-6h，再将犬细小病毒以0.01-0.03MOI的接种量接入培养液中，然后进行细胞培养。

[0018]优选的，步骤3)中，待微载体上的细胞全部脱落后一种犬细小病毒的增殖方法，取培养液进行固液分离，收集上清液，即得犬细小病毒液。

[0019] 优选地，所述细胞培养液包括以下成分：85-90％(w/w)的DMEM溶液，80-120单位/ml的青霉素钠，80-120单位/ml的链霉素，余量为牛血清；培养基pH为7-7.8。

优选的，步骤1）中细胞的培养或步骤2）中接种犬细小病毒后细胞的培养满足如下培养条件：培养温度35-39℃，培养液pH值7-7.8，培养液溶氧45-55%，搅拌速度50-70rpm。

上述技术方案中，生产性F81细胞及生产性犬细小病毒种毒均由原代种子活化传代获得；培养细胞及接种病毒需利用EDTA-胰蛋白酶细胞分散液消化，所述EDTA-胰蛋白酶细胞分散液的配方可以为：规格1:250胰酶的PBS液，含质量体积分数0.25%的0.02%EDTA ;其中规格1:250胰酶即为每克胰酶中含250个活性单位的胰酶；所述微载体可选自商品型号的Cytodex系列微载体，例如可以为型号Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3的微载体，微载体在使用前，需进行清洗、灭菌，具体步骤为：1)称取Cytodex微载体500g，用20L PBS液浸泡过夜； 2）用1L PBS溶液清洗3次；3）加入1L PBS溶液浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌30分钟；将微载体加入反应器中犬细小，用DMEM清洗微载体。

本发明方法创新性地利用F81细胞作为犬细小病毒的宿主细胞，特别有利于病毒的增殖；采用急流生物反应器较传统的翻瓶法工艺更易控制，产品质量更稳定；采用微载体的培养方式，可以充分利用培养液，保持贴壁细胞的生长特性，同时实现高密度培养的效果。同时，本发明针对F81细胞的培养环境、犬细小病毒自身特性及生物反应器匹配特定的培养条件，从培养液组成、接种量、条件参数等方面进行优化设计，使犬细小病毒增殖效率显著提高。本发明以巧妙的技术构思实现了突出的技术效果，且成本相对较低，易于实现，具有突出的推广前景。

【详细方式】

[0023] 以下将详细描述本发明。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中将不再详细描述已知的结构或功能。除定义外，以下实施例中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

[0021] 实施例1

1. 生产细胞的传代和培养

取生长良好的F81细胞，用EDTA-胰蛋白酶细胞分散液（EDTA-胰蛋白酶细胞分散液为含有质量体积分数为0.25%的1:250胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS溶液；其中，规格1:250胰蛋白酶为每克胰蛋白酶中含有250个活性单位的胰蛋白酶）消化传代，用含有90%DMEM溶液、10%牛血清、100单位/ml青霉素钠和链霉素钠的细胞生长液继续培养，调节pH为7.4，培养温度为37℃，形成良好的F81细胞单层，传代后用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。

2. 种子毒药的生产繁育

F81细胞培养2天形成单层后倒出细胞生长液，用EDTA-胰蛋白酶消化细胞分散液，将分散液与步骤1中的生长液混合，按1：2比例分装后培养4-6小时。接种犬细小病毒，犬细小病毒接种量与细胞生长液体积比为1：50。将细胞液与病毒液混合并充分浸没细胞，置于37℃、5％体积比二氧化碳培养箱中培养。 逐日观察，当80%-85%的细胞出现病理变化时，收获病毒，置于-20℃冰箱中，反复冻融三次，使病毒从细胞中充分排出，然后将病毒液分装，置于-70℃或液氮中备用。此病毒液作为生产病毒。

3. 生物反应器中F81细胞的微载体悬浮培养

[0030] 在装有已通过无菌试验的微载体的生物反应器中加入总培养体积2/3体积的细胞生长液，取步骤1中已形成良好单层的F81细胞，用EDTA-胰蛋白酶细胞分散液消化制成细胞悬浮液。细胞计数后，以5×10细胞/ml至5×106细胞/ml的细胞密度接种于生物反应器中。生物反应器设定培养温度为37℃，pH为7.4，溶氧含量为50％，搅拌速度为60rpm，自动控制反应器培养，其中，生物反应器容积为75L；微载体为Cytodex系列微载体，Cytodex系列微载体包括Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3。微载体使用前需清洗、灭菌。 具体步骤为：1）称取500g Cytodex微载体，放入20L PBS溶液中浸泡过夜；2）用1L PBS溶液清洗三次；3）加入1L PBS溶液浸泡微载体后，121℃蒸汽灭菌30分钟；将微载体加入反应器中，用DMEM清洗。

[0031] 4.抗原病毒液的增殖

[0032] 培养后第三天，观察微载体上的细胞基本饱满，用EDTA-胰蛋白酶消化细胞分散液，将分散液与步骤1中的生长液混合，细胞计数结果达到5×10 细胞/ml?5×10 7 细胞/ml。继续培养4?6小时时，细胞吸附在微载体上进行病毒接种。种毒为步骤2中的生产种毒。病毒培养液配方为：90％DMEM溶液、10％牛血清、青霉素钠和链霉素各100单位/ml，pH7.4；接种量为0.02MOI；生物反应器设置参数为培养温度37℃、pH7.4、溶氧50％、搅拌速度60rpm，反应器自动控制培养。 病毒接种后，定期取走反应器内的微载体，在显微镜下观察细胞病理情况。

5. 病毒液的收获

当微载体上细胞全部脱落，DO值呈明显上升趋势时，反应器内的液体连同微载体一起